活体肝内华支睾吸虫计数条

活体肝内华支睾吸虫计数9974条王国志朱丽贤陈光中图分类号：R532．23文献标识码：C胆总管T型管引流术为寄生虫学观察人体对华支睾吸虫的耐受量及驱虫药的疗效观察提供了直接的途径，这是肝胆外科学与寄生虫学的有机结合。王国志等先后利用这一途径观察了吡喹酮治疗华支睾吸虫的疗效及一女性患者感染华支睾吸虫的计数[：，2)。最近我们又用同样方法对1例男性患者进行了活体内虫体计数，共获虫体9974条。这是目前国内外文献中活体准确计数虫体最多者，报告如下。1病例患者崔XX，男，46岁，农民。1999年12月19日以急性胆绞痛入佳木斯市中心医院住院治疗，病案号0，经B超检查：肝内有多发性结节占位，胆囊息肉，胆囊结石。既往史：由于定居松花江岸边，喜欢捕鱼，并经常吃生鱼，大小鱼兼有，平时经常出现上腹部胀痛、背部放射痛，但未引起重视，本次上腹部疼痛难忍，才来就诊。采用外科手术治疗，切除胆囊，插丁型管引流，术后出现黄疸，经T型管逆行造影发现胆管低位狭窄及壶腹部结石嵌顿，对症处理，术后20天带引流管出院。医嘱2个月后来院复查，由于术者满足于并发病的诊断和治疗，而忽视了真正病因的探讨，出院后患者发现引流液中排出虫体数十条，速来我室鉴定为华支睾吸虫，随后给予吡喹酮驱虫，剂量16．6mg／(ks次)，山总剂量为9000mg，服药后即开始收集虫体记数，3d共获虫体9974条，虫体压积75ml，多数为活虫，虫体外表光滑完整。通过对虫体外形观察，9974条虫体明显分为远期感染者538条，近期感染者9436条。远期感染的特点是虫体较大、平均大小为13．8mmx3．3mm。颜色深暗，红黑色。近期感染者虫体较小，平均大小为9．immx2．1mm；大小一致，颜色鲜艳，淡红色，子宫内充满虫卵，均发育成熟。2讨论2．]本患3d排出虫体9974条，尚不包括用药前自然排出的虫体及T型管通往肠道端排出的虫体。这是目前活体排虫最高记录。该患虽已出现严重的并发症，但平时仍能从事繁重的田间劳动，表明人体对华支睾吸虫耐受量极大，看来，以往文献中认为人体感染1000条以上就可出现致命性危害的提法[，J是不妥的。2．2感染的虫体明显分为两期感染，这是以往观察未见到的现象，近期感染虫体数量之多，超过远期感染20倍，这表明人体对华支睾吸虫的带虫免疫力极其低下。从而重复感染使肝脏内虫体数量累积增加，最后致病或出现并发症。这是防治中不容忽视的问题。2．3观察中还发现远期感染虫体先排出，近期感染虫体后排出，这可能与(1)远期感染者寄生部位离肝门较近，而后感染者在移行时必须越过已被占据的胆管到更次级的阻管寄生，因而排出时间滞后；(2)远期感染虫体寄生时间长，虫体衰老，耐受差有关。但一个疗程驱虫尚不彻底，提示重度感染者重复用药的必要性。3参考文献1．王国志，蔡连顺，王宝来．吡喹酮治疗华支睾吸虫病胆总管T型管引流观察臼)．中国人兽共患病杂志，1998，14(1)：178．2．蔡连顺，肖景莹，陈光．肝胆管T型管引流6446条华支举吸虫山．中国人兽共患病杂志，2000，20(1)：119·，3．刘宜升，陈明．华支睾吸虫的生物学和华支睾吸虫病防治[M)．北京：科学出版社，1998，76．2000年3月26日收稿作者单位：佳木斯大学基础医学院寄生虫学教研室(佳木斯，)检出率22．82％。一些鱼种(带鱼、海鳗、大黄鱼、小黄鱼、大眼鲷等)异尖线虫幼虫感染率高达22．22％一93．33％，其他检出阳性的鱼种其感染率均达10％以上。这对于当地居民喜食生鲜海产或食未熟透海鱼的情况应引为关注。本调查与同类资料c，o的鱼种阳性率60．20％、总检出率36．50％的结果比较，略显偏低。这可能与样品产地来源、采样季节、鱼类的大小及某些高感染率的鱼种采样数量等方面有关。另外，由于条件及材料所限，未能对鱼体肌肉虫体进行检查。本调查阴性鱼尾数占所检鱼总尾数的77．18％(257／333)，加上休鱼期2个月减少了样本量，致某些样品无阳性检出或检出率偏低。调查显示，虫种以异尖线虫幼虫感染为高。总感染率为21．62％。高感染率的鱼种有带鱼、诲鳗、大黄鱼、小黄鱼，分别为93．33％、81．82％、50．00％和25．0096。另有5种6尾检出对盲囊线虫幼虫，6种6尾检出宫脂线虫幼虫。一尾同时感染两种异尖线虫科幼虫的有大黄鱼(对盲囊+宫脂、异尖+对盲囊)、大眼鲷(对盲囊+宫脂)、狗母鱼(异尖+对盲囊)、金线鱼(对盲囊、宫脂)、斑虎鲛(对盲囊、宫脂)。这些结果基本反映当地市售海鱼的异尖线虫幼虫感染情况，提示市售海鱼有较高的感染率，如有不良的饮食习惯可使人体有感染的危险性。(虫种鉴定得到广西大学黄维义教授的指导，特此致谢)4参考文献1．孙世正，等．近海鱼类异尖线虫幼虫感染的初步调查．寄生虫学与寄生虫病杂志．1986；(4)；181．2．黄维义．摄食海鱼与异尖线虫病．中国寄生虫学与寄生虫病杂志．1998；16(4)：300．3．孙世正．南海、渤海鱼类简单异尖线虫幼虫感染的调查．中国寄生虫学与寄生虫病杂志．1996；14(3)：173．2000年3月16日收稿2000年6月25日修回2001，17(1)中国人兽共患病杂志ChineseJournal“Zoonoses文章编号：1002-2694(2001)01—105—02华东地区近30年发现的黑热病病例分析徐宏秀付婷霞毛德华高歌中图分类号：R382．2文献标识码：C黑热病是一种严重危害人民健康的寄生虫病，在我国曾流行在长江以北的广大地区，山东、苏北、皖北平原是重流行区之一[1)。新中国成立后，普遍开展了黑热病的防治工作，使患病率逐年下降，至1958年先后达到基本消灭黑热病的标准，继而转入监测，病例更趋少数。根据本所诊治及1980年全国黑热病防治科研会议上交流的资料，70年代以来共确诊黑热病31例(2，3)，现分析如下。1确诊年份及地理分布自1970年以来在上述三地区共确诊病人31例，均查见利什曼原虫，其中有12例同时做间接荧光抗体试验，结果亦呈阳性。31例患者中，70年代确诊的有24例，80年代5例，90年代2例。31例患者中，来自山东省的有19例，分布于17个县市；苏北11例，分布于9个县市；皖北的1例则发生在从未出现过此病的怀宁县，该例黑热病病人系在山东省寄生虫病防治研究所确诊并治愈。该患者为男性，26岁，1987—1988年间曾去甘肃省的流行区文县、武都一带经商，可能在该地感染。2性别与年龄在31例黑热病患者中，男25例(占80．6％)，女6例(占19．4％)。确诊时的年龄：15-25岁l例(3．2％)，26—35岁14例(45．2％)，36—45岁2例(6．4％)，46—55岁1l例(35．5％)，56岁以上者3例(9．7％)。最小年龄15岁，最大年龄74岁。3发病年份及病程对24例分析发现，在1950年前因黑热病症状、体征并接受锑剂治疗者4例，占16．7％；1951—1960年出现症状经锑剂治疗者3例，占12．5％；1961—1970年13例，占54．1％；1971—1980年3例，占12．5％；1981—1990年l例，占4．2％；以上患者均给予锑剂治疗。其病程2—5年者6例(25．0％)，6—10年者4例(16。7％)，ll—15年4例(16．7％)，16—20年7例(29．1％)，30年以上者3例(12．5％)。4临床症状与分型本文报告的黑热病31例病例，分别有不规则发热，脾脏肿大，有的亦有肝脏肿大。鼻出血及皮肤、粘膜出现大小不等的结节者17例，大者似核桃，小的如粟粒，一般为黄豆大小，有的孤立散在，有的融合成团，不痛不痒无溃烂。根据临床症状体征以及病原检出部位，大体分为3种类型：(1)内脏黑热病，共有14例，占45．2％。(2)内脏黑热病并发皮肤捌黑热病有3例，占9．6％，其中1例用葡萄糖酸锑钠治疗过，内脏黑热病未完全治愈，而25年后，内脏与皮肤黑热病症状同时出现。(3)皮肤黑热病14例，占45．2％，其中有10例先患有内脏黑热病，用锑剂治愈后数年甚至数十年，而又出现了皮肤损害，其余4例从无黑热病史，亦未有内脏黑热病症状，髂骨、脾、肝穿刺涂片均未查到利什曼原虫，仅从皮肤损害处(结节)刮取组织液涂片，镜检查到利什曼原虫，为原发性皮肤黑热病5诊断与鉴别诊断检查到利什曼原虫是确诊黑热病最可靠的方法。一般通过穿刺，抽取病人的骨体、脾、肝、淋巴组织液或皮肤涂片，用瑞氏或姬氏等染色镜检，查到利什曼原虫方可确诊。我们采用间接荧光抗体试验诊断黑热病，其患者几乎全部呈阳性反应，滴度最高者可达1：。黑热病流行区的居民或在流行区居住过的人，出现脾脏肿大，伴有不规则发热等症状，理应考虑黑热病的可能性。但由于人源型黑热病流行地区，早已宣布基本消灭，致使广大医务人员认为黑热病已不存在，从而造成长期误诊误治。本文17例内脏黑热病，分别被误诊为脾功能亢进、肝炎、肝硬化和高球蛋白血症等，有的病例误诊长达一、二十年。其中有4例被诊为班替氏综合征，决定施行脾切除术前，经进一步化验检查才确诊为黑热病。14例皮肤型黑热病，多数曾一度被诊为瘤型麻风，个别病例被误诊为酒渣鼻、纤维瘤、黄色瘤等。如遇有上述类似病例，应以症状、病原及免疫诊断学加以区别。6治疗葡萄糖酸锑钠(斯锑黑克)是治疗黑热病的特效药物。本文患者用葡萄糖酸锑钠治疗的25例，用戊烷脒治疗5例皮肤型黑热病，还有1例内脏并发皮肤黑热病患者，先用一个疗程的斯锑黑克治愈，2年后又复发，后改用戊烷脒治愈。由于这些患者病程较长，又包括一部分皮肤型黑热病，斯锑黑克的疗效比大流行时期黑热病治愈率低，需要加大剂量，至少2—3个疗程才能奏效。根据我们的经验，采用戊烷脒治疗皮肤型黑热病优于斯锑黑克，一般只需1个疗程(4m沙 k8日，每日肌注一次，共15—20次)，可达治愈，仅有个别病例才需第二个疗程。7讨论华东地区的黑热病从流行病学上看属于人源型黑热病流行地区，在1958年已达基本消灭的要求，随后病人越来越少。70年代原有的流行区已成为黑热病的非流行区，从此未有在当地感染的新病例。本文病例几乎都是误诊误治或未获彻底治愈的患者，病程在6年以上的占80％，最长的达作者单位：山东省寄生虫病防治研究所(济宁，2n033)106中国人兽共患病杂志ChineseJournalOfZoonoses2001，17(1)文章编号：1002-2694(2001)01—106—01裂头蚴感染人体1例报告林哲杨明中图分类号：R532．31文献标识码：C裂头蚴病，是人、兽、禽类共患的常见病与多发病，在医院门诊和外科手术中经常见到。现报告l例。患者黄XX，女，23岁，贵州农民。1998年10月由贵州农村到广州佛山市打工。12月因右侧大腿发现一个指头大小的肿块到本院外科门诊就诊。病史：在贵州农村老家有经常用生青蛙肉捣烂敷贴伤口的习惯和历史。体检：右大腿内侧皮肤红肿并隆起一个2cmX2cm的肿物，边清、质中，轻度压痛。拟诊：右大腿肿物摘除病因待查。手术：局麻后切开皮肤行肿物离体摘除。切除的肿物经剖开发现一条乳白色会蠕动的虫体，长19．8mm，宽2mm，虫体扁平呈链状，在生理盐水中能不断伸缩活动。虫体固定后经福建省寄生虫病研究所林金祥主任医师染色制片鉴定为：曼氏迭宫绦虫的幼虫——裂头蚴。讨论：裂头蚴是曼氏迭宫绦虫的蚴虫，它感染人体的危害远比成虫大。迄今为止，裂头蚴感染人体并致病者，我国已报告623例，分布在我国的23个省、市、自治区，其中广东、福建、吉林、四川、广西、湖南、海南7省、区占468例uj。裂头蚴在人体寄生的部位，根据362例分析，寄生于眼部141例，占患者总数的39％；口腔、颌面部94例，占26％；胸壁、腋下24例，占3．9％；腹壁及腰背部40例，占11．1％；乳房7例，占1．9％；四肢、腹股沟33例，占9．2％；脑部11例，占3％；外阴、卵巢、附睾、精索等生殖系统18例，占5％；肾周围组织、呼吸道、消化道及全身者各1例，占0．28％。上述患者中除裂头蚴寄生全身1例外，寄生部位超过两处的有13例12J。曼氏迭宫绦虫的终末宿主，主要是狗、猫等动物，它是人、兽、禽类共患的寄生虫，广泛分布于亚洲、非洲、大洋洲和欧洲。其生活史需经过3个宿主。成虫寄生在狗、猫等终末宿主的小肠内，卵自子宫排出后，随粪便排出体外，在水中孵出钩球蚴，被第一中间宿主剑水蚤吞食后，发育成原尾蚴。带原尾蚴的剑水蚤被第二中间宿主蝌蚪吞食后，即发育成裂头蚴，这些带裂头蚴的蝌蚪逐渐发育至成蛙。含裂头蚴的蝌蚪或成蛙，被狗、猫等终末宿主吞食，即发育成成虫；如被不适宜的转续宿主如爬行类和禽类等动物吞食，裂头蚴则停止发育，处于滞育状态，长期停留在这些动物体内，这些带有滞育虫体的转续宿主，一旦被适宜宿主吞食，它又可继续发育为成虫。裂头蚴感染人体的途径有两条：一是裂头蚴或原尾蚴直接经皮肤或粘膜侵入；二是误食裂头蚴或原尾蚴。其感染方式主要有如下3种：(1)带裂头蚴的蛙、蛇肉敷贴伤患部，裂头蚴直接侵入。我国南方民间流传生蛙、蛇肉有清热解毒之功效，因此，常将生蛙、蛇肉捣烂直接敷贴伤口，为裂头蚴侵入人体创造了条件。(2)生吞蝌蚪、蛇胆或进食未熟透的蛙、蛇肉或其它含有裂头蚴的动物肉类而感染。(3)饮用含有原尾蚴的剑水蚤的生水。裂头蚴感染人体后的临床表现及特征，因寄生部位而异。如寄生在深部组织，常无症状或体征，如在皮下肌肉内寄生，局部可有肿胀、压痛、发炎或虫爬感，皮下可触及结节状的小肿块，边界清晰，可移动，大小如指头。确诊须检及虫体。其治疗主要靠手术取虫。吡喹酮药物治疗有一定疗效[3)。其主要预防措施，是加强健康教育，提高人们对裂头蚴病危害性的认识，改变饮用生水和生吞蛙胆及局部伤口敷贴生蛇肉、生蛇皮的不良卫生习惯。参考文献1．许隆祺，余森海，徐淑惠．中国人体寄生虫分布与危害(M)．北京：人民卫生出版社，1999．227．2．于思庶，等．中国人兽共患病学[M]．第2版，福州：福建科技出版社，1995，950．3．王小根，等．吡喹酮治疗孟氏裂头蚴病二例报告0)．中华内科杂志，1982，21(5)：284．2000年9月24日收稿作者单位：广东省佛山市人民医院(佛山，)35年之久，到目前为止，尚属国内外病程最长的病例。此患者3岁时患黑热病，虽经用斯锑黑克治疗，但未治愈，至34岁时，身上出现大小不等的不痛不痒、不溃烂的结节，在山东省寄生虫病防治研究所确诊为内脏并发皮肤黑热病，至38岁时才得以治愈。亦有的患者，用斯锑黑克治愈后，二三十午后又复发。此外，又因人口的流动，也可能在外地感染成为输入进来的黑热病病例u。因此医疗和卫生防疫人员如遇有不规则发热、肝脾肿大，按其他病治疗未获治愈，不论病程长短均应考虑有黑热病的可能性。在诊断上，除根据症状、体征、病原检查外，还可采取患者耳垂血，滴在滤纸上，寄给有关单位，做间接荧光抗体试验或酶联免疫吸附试验，以便协助诊断。8参考文献1．王兆俊，吴征监．黑热病学[M)．北京：人民卫生出版社，1956，260．2．邵其峰，王兆俊．山东省黑热病基本消灭后三十年的监测CJ)．中国寄生虫病防治杂志，1989，(增刊)：1．3．吴中兴，等．江苏省黑热病防治历史经验．内部资料，1985．4．颜秋叶，等．输入黑热病1例报告臼)．实用寄生虫病杂志，1994，2(4)：43．1999年7月29日收稿1999年12月10日修回2001，17(1)中国人兽共患病杂志ChineseJournalOfZoonoses107文章编号：1002—2694(2001)01—107—02湖北省消灭黑热病后的白蛉监测左胜利桂爱芳吴锦华胡乐群杨连第张绍清付在凤中图分类号：R384．1文献标识码：C湖北省中北部曾是黑热病流行较严重的地区，据疫情报告，1954年发病率为8．3／10万，经过全面的防治，发病率逐年下降，1958年宣布基本消灭。此后，进一步肃清传染源和扑灭媒介白蛉，多次抽查、考核，未发现新的病例。但1989年以来，又陆续报道“黑热病'14例，为了查明黑热病在湖北地区的流行情况，我们于1997—1998年开展了黑热病的流行病学调查，对其传播媒介白蛉进行调查和监测，现将结果报告如下：1方法7．]监测地点在老疫区和有“新病例”报道的22个县(市)，即襄阳、枣阳、随州、南漳、潜江、麻城、蕲春、孝南、当阳、恩施、安陆、丹江口、阳新、宜城、老河口、罗田、沙市、钟祥、京山、天门、荆门、宜昌L真j，每个县(市)选择1—3个乡(镇)，每个乡(镇)选择1-2个自然村；在有“新病例”报道的县(市)，以“病例”所在的自然村作为监测点。]．2监测方法每个监测点调查村民100户，在白蛉密度高峰季节(6、7、8月)，定点、定人，白天对野外洞穴、夜间对人房和畜舍进行捕蛉，采用统一下发的捕蛉管和捕蛉纸，捕蛉纸为涂蓖麻油的8开白纸，每个监测点约70张，于夜晚8时悬挂在白蛉出没的地方，用灯光诱捕，次日早晨8时取回，收集粘在纸上的白蛉，每3天一次，共7次，按“人工小时”计算白蛉密度，记录当天的时间、温度、湿度和风力；白蛉标本用75％酒精浸泡，由湖北省医学科学院寄生虫病研究所专业人员组织鉴定。1．、1998年，在京山县先后举办了2期“湖北省黑热病防制和监测培训班”，对开展白蛉调查和监测的县(市)级卫生防疫专业人员进行培训，全省统一方法。2结果1997—1998年6、7、8月，在湖北地区的22个县(市)41个乡(镇)63个自然村，共调查人房2589间，畜舍1162间，室外640处，洞穴24个，悬挂捕蛉纸2378张，共捕获白蛉1208只，其中在随州市捕获54只、在南漳县捕获39只、在安陆市捕获78只、在京山县捕获1037只，其他18个县(市)未捕到白蛉；经鉴定，8只为鲍氏白蛉(在京山县雁门口乡捕获)，占总数的0．66％，l200只为鳞喙白蛉，占总数的99．38％，没有发现中华白蛉(见表1)。3讨论湖北地区解放前无黑热病传播媒介——白蛉的调查报告。1957—1958年调查，在宜城、襄阳、荆门、随州、枣阳等县(市)共发现中华白蛉(Phlebotomuschinensis)，江苏白蛉(户．kiangsuensis)，鲍氏白蛉($ergentom2iabarraudi)，南京白蛉(S．nankingensis)，鳞喙白蛉(S．sguamirostris)5种[2l，1959年贵立鳌等报告，湖北有蒙古白蛉(户．mongolensis)[3)，表l湖北地区白蛉监测结果1986年冷延家等调查湖北的白蛉相，又发现安徽司蛉(S．an· huiensis)、歌乐司蛉(S．koloshanensis)、征鉴司蛉(S．zhen印an— i)，共计9种[4l。以往的调查结果显示，在黑热病流行区病灶周围仅发现江苏白蛉、鲍氏白玲、鳞喙白蛉、中华白蛉4种。1957年襄阳县调查，共鉴定2628只白蛉，其中江苏白蛉 l218只(46．34％)、鲍氏白蛉932只(35．46％)、鳞喙白蛉459只(17．46％)、中华白蛉19只(0．54％)。1958年在荆门、宜城等地调查，共鉴定1965只白蛉，其中江苏白蛉l221只(62．13％)、鲍氏白蛉385只(19．59％)、鳞喙白蛉313只(15．92％)、中华白蛉45只(2．29％)、蒙古白蛉1只(0．07％)。室内外白蛉栖息情况，1957年襄阳县的调查结果为：中华白蛉、江苏白蛉、鳞喙白蛉、鲍氏白蛉在室内分别占其总数的94．8％、1．7％、0．5％、0．4％。而在室外则分别占其总数的5．2％、98．3％、99．5％、99．6％，说明在湖习匕省的黑热病流行区，中华白蛉并非为白蛉种群中的优势种。1975—1976年湖北省医科院寄研所在襄阳、枣阳、宜城、均县、荆门5个县(市)，收集室内外土壤92处、采取(下转第35页)作者单位：湖北省医学科学院(武汉，)108文章编号：1002—2694(2001)01—108—02中国人兽共患病杂志ChineseJournalOfZoonosesPCR技术在钩端螺旋体病传染源监测中的应用蒋秀高’聂一新，顾莉莉’肖玉春’时曼华’中图分类号：R377文献标识码：C钩端螺旋体(钩体)病在我国分布广泛、流行严重，自1955年被列入法定传染病以来，全国累计病例240多万人，死亡病例超过2万人。钩体病属自然疫源性疾病，为了有效控制钩体病流行，必须加强对钩体病传染源带菌情况进行监测。野鼠是钩体病最重要的传染源，其次是猪、犬、牛等。目前，监测传染源带菌率主要是靠钩体菌分离培养，但受各种因素影响，如杂菌污染、培养基质量不高、农药的使用等，致使钩体培养阳性率不高。因此，本文介绍多聚酶链式反应(PCR)技术用于钩体病传染源带菌率监测，提高钩体病的疫情监测质量。]材料与方法1．1材料]．]．1实验动物金黄地鼠来自本所实验动物室，现场野鼠肾组织标本由安徽省卫生防疫站采自安徽省黄山区。]．1．2引物采用荷兰皇家热带研究院世界卫生组织钩体病参考中心设计的一对引物G1／G2，由中国科学院微生物所基因工程中心合成。引物序列为G1：5+TGAATCGCTG—TATAAAAGT3’，G2：5’GGAAAACAAATGGTCGGAAG3’。1．1．3主要试剂吸附剂(Diatom)：JANSSENCHIMICA产品；异硫氰酸胍：Fluka产品；TaqDNA聚合酶、dNTPs、分子量标准等试剂为华美生物工程公司产品。]．2方法1．2．1金黄地鼠人工感染钩体取菌量为2x108／nU钩体(赖株)注射地鼠腹腔，5d后地鼠死亡，无菌操作取其肾、肝、心脏器组织，—20'(3保存。1．2．2PCR敏感性检测在正常地鼠肾组织中掺入钩体菌，标本中钩体菌量依次为lOs、10+、103、102、101、10~条，组织阴性对照不掺入钩体。1．2．3现场野鼠肾组织标本置—20C保存，解冻后直接提取钩体DNA模板。1．2．4模板提取动物组织标本中钩体DNA模板提取采用Boom法山，具体操作如下：动物组织标本用匀浆器研磨成组织匀浆，加lml组织裂解液(10mMTris、25mMEDTA、 lOOmMNaCl、0．05％SDS、0．1m沙nd蛋白酶K)置37℃水浴过夜，以r／min离心20min；取上清0．1ml加裂解液(120g异硫氰酸胍、100ml0．1M pH6．4Tris—HCl、22ml0．2MEDTA、2．6gTritonX一100，pH8．0)0．9ml；力口Diatom(Celitelog、浓盐酸0．5mi、三蒸水50m1)40山充分混悬，以r／min离心5min弃上清；用lml洗涤液(120g异硫氰酸呱、lOOml0．1MpH6．4Tris—HCl)洗涤二氧化硅—DNA复合物，r／min离心5min，2次；75％乙醇洗涤复合物，r／min离心，2次；丙酮洗涤复合物，r／rnln离心，1次；置65C水浴干燥10min；加70山三蒸水充分混合10min，√rain离心5min；取上清于一新管加10rug／nd蛋白酶K2．5山，置56C水浴作用10min；煮沸10min灭活蛋白酶K，—20C保存或直接用作PCR模板。1．2．5扩增反应10xPCR缓冲液2．5山、dNTP2山(终浓度各0．2mM)、引物(G1、G2)各I／A(均为20pmol／／真1)、MgCU1．5山(终浓度1．5mM)、TaqDNA聚合酶0．5山(1．5U)、DNA模板5山，补水至25弘l，加灭菌石腊油1滴，置扩增仪循环。1．2．6热循环条件设置95C预变性5min；变性为94℃2min，退火为55C lmin，延伸为72C2min，共35个循环；最后延伸72℃10min．]．2．7扩增产物的检测在1．5％琼脂糖凝胶中掺入溴化乙锭(0．5弘以nd)，选用0．5xTBE电泳缓冲液，50V恒压电泳2h后在紫外检测成像系统观察结果，阳性扩增产物为285bp，将图像存入电脑，热敏打印机输出。2结果2．]人工感染钩体地鼠脏器组织标本检测结果人工感染钩体的地鼠，5d后动物死亡。无菌操作取其’肾脏、肝脏，心脏组织标本提取钩体DNA作模板进行PCR扩增反应，以钩体菌赖株作菌液对照。结果钩体菌液、地鼠肾脏、肝脏、心脏，以及钩体DNA对照均能扩增出特异性的285bpPCR产物，而正常地鼠肾脏不能扩增出285bpPCR产物，见图l。图1人工感染钩体地鼠脏器PCR检测结果1．100bpPCRLadder(100--1000bp)；2．钩体菌对照；3．肾脏组织标本；4．肝脏组织标本；5．心脏组织标本；6．正常地鼠肾组织标本(阴性对照)；7．钩体DNA(阳性对照)。2．2PCR检测组织中钩体敏感性将正常地鼠肾组织研磨成组织匀浆，钩体赖株计数后作10倍连续稀释后分别掺入正常地鼠肾脏组织中。结果，大约含10条钩体的组织标作者单位：1．中国预防医学科学院流行病学傲生物学研究所(北京，)2．安徽省卫生防疫站2001，17(1)中国人兽共患病杂志ChineseJournal ofZoonoses109本提取的DNA模板，通过PCR能扩增出特异性的285bp产物：茵演标本提取DNA扩增阳性，低下10条钩休的组织标本．正常肾脏组织对照均不能扩增出特异性的PCR产物，见图!：285bp图!钩体菌的PCR检测敏感性测定1．100bpPCRLadder(100--1000bp)；!．阴性对照(不加模板)3．钩体菌液对照；4—9．标本中钩体菌量依次为105、104．103．102．101、10。条：10．组织对照(不掺入钩体茵)。2．3现场野鼠肾组织标本检测结果从安徽省黄山区现场捕获的野鼠，取’旨组织作钩体菌培养，结果90份标本中，培养阳性2份：从这90份野鼠肾脏组织中提取钩体DNA作模板，进行PCR扩增，结果4份阳性(图3，3、4、5、7泳道)，PCR扩增阴性的际本，钩体培养均为阴性；5004山 bp]285bp模板，获得285bp的特异性扩增产物，而非致病性钩体和其它细菌均不能扩增出285bp的产物(2．3)+Ba3等[d’比较了PCR和钩体培养两种方法检测发病不同阶段的病人尿液钉本的敏感性，发现PCR比钩体培养敏感性高一倍，PCR检测的敏感性达90％。在发病第8d前同时采集7例病人的血液和尿液标本进行PCR检测，结果所有7例早期尿液标本均呈阳性，而血液标本只有2例阳性，认为尿液PCR检测用于早期诊断钩体病更可靠。6例病人接受抗生素治疗后，尿液PCR检测仍为阳性。有些病人尿液在发病后数年PCR检测呈阳性，说明钩体病人肾带菌时间比预想的时间长得多+Brown等15j用PCR方法检测临床急性钩体病感染者，71例患者的尿液和血液标本分别用作PCR检测、钩体培养和血清学检测。44例(62％)尿液PCR检测为阳性，34例(48％)钩体培养阳性。13例患者尿液PCR检测早于血清抗体的检出，包括2例病人患病期间和死亡时血清抗体阴性。16例患者血清抗体检测、钩体培养为阴性，PCR检测也为阴性，由此肯定PCR在钩体病早期诊断中不仅敏感性高，而且特异性强，具有重要价值。本文在预试验中，在动物组织标本中掺入不同钩体菌量，分别采用煮沸法、酚／氯仿法和Boom法提取模板，结果煮沸法提取的模板PCR扩增全为阴性，酚／氯仿法提取模板PCR检测敏感性大约为1000条钩体，Boom法提取模板PCR检测敏感性大约为10条钩体。实验室人工感染钩体的地鼠，其肾脏、肝脏和心脏组织PCR检测均呈阳性，从安徽省黄山区采集的90份野鼠肾脏标本，钩体培养2份阳性．PCR检测4份阳性。因此，我们认为PCR技术用于钩体病传染源带菌率监测，能有效提高钩体病疫情监测质量，建议广泛推广使用。4参考文献1．RBoom，CJASol，MMMSalimans，eI山．Rapid andSimple图3现场野鼠肾组织标本的PCR检测1．100pbPCRLadder(100--1000bp)；2--9．野鼠组织标本；10．阳性2对照：11．阴性对照?3讨论，临床上有许多钩体病患者，因误诊、漏诊延误治疗而导致肺弥漫性出血、肝肾功能衰竭而死亡，国内外学者非常重视钩体病的早期、快速诊断方法的研究。Boom等人采用高 q效吸附剂(Diatom)能从病人的血液、尿液标本中提取到非常微量的钩体DNA作模板，进行PCR扩增检测钩体菌，用于以钩病人的早期快速诊断。荷兰皇家热带研究院世界卫生’组织钩体病参考中心，从黄疸出血型RGA菌株基因库中经多次亚克隆筛选出一段核苷酸序列，并根据其末端序列设计出一对引物G1、G2，能特异性扩增致病性钩端螺旋体的DNAMethodfOrPurificationofNucleicAcidsUj。JournalofClinicMicro— biology，1990，28(3)：495．GravekampC，Van deKemp．HFramen，et a1．DetectiOnOf scven speciesof pathogenic leptospires byPCR using two sets of primersUJ．JGenMicrobiol，1993，139(8)：1691．Parma，A，SeijoA，LucchesiP，etal．Differentiationofpathogenicand non—pathogenic leptospires by means of the polymerase chain reac- tlon[J]．Rev lnstMedTropSaoPaulo，1997，39(4)：203．BalA，GravekmmpC，HartskeerlR，et a1．Detection of leptospires in urinebyPCRforearlydiagnosisofleptospirosisU)．JClinMicrobiol，1994，32(8)：1894．BrownP，Gravek~mpC，CarringtonD，et a1．Evaluation of the poly— merasechain reaction for early diagnosis of leptospirosis[J)．JMedMierobiol，1995，43(2)：110．2000年4月19日收稿110中国人兽共患病杂志ChineseJournalOfZoonoses2001，17(1)文章编号：1002-2694(2001)01—110—0258例小儿结核病临床特点及其诊治潘家华刘欣陈兰举中图分类号：R52文献标识码：C近年来，小儿结核病发病率呈上升趋势。由于临床表现极不典型，易误诊误治：真)，尤其结核性脑膜炎患儿，若不能及时正确诊治，将预后不佳12)。特对我院1994年6月一1999年6月收治的58例分析报告如下。1资料与方法1．1一般资料患儿为我院小儿结核病专科门诊及住院病例，男41例，女17例。年龄：一1岁3例，一3岁12例，一7岁22例，一13岁21例。近期有麻疹史l例，有营养不良10例，有结核接触史10例。5例婴幼儿结脑未接种卡介苗或无卡介苗疤痕，其余接种时间均超过5年。58例中肺结核23例、结核性脑膜炎25例及淋巴结结核10例。1．2临床表现发热31例；头痛10例，性格改变2例，昏迷7例，抽搐11例，瘫痪4例，脑膜刺激征24例，颅神经损害6例，肌张力增高3例；结核中毒症31例；咳嗽12例，喘息5例，胸闷2例，有反复呼吸道感染史20例；p区吐18例，腹泻7例，粘液血便3例，腹痛5例，肝大2例；颈淋巴结肿大8例；腹胀、便秘、巨脾、血尿、尿失禁及外阴溃疡伴阴道分泌物增多、皮肤出血点各1例。]．3实验室、影像学及病原学检查轻度贫血8例，中度贫血2例，WBC>10x10~／L10例，N>0．6者20例，ESR升高12例，sGPT增高5例。CSF改变不典型，很难与治疗不彻底的化脓性脑膜炎及病毒性脑炎鉴别；胸片改变多样性，且无特异性；头颅CT脑室扩大较多见，且有早期诊断价值。组织切片改良抗酸染色及酶标组织化学查见结核菌L型对淋巴结结核诊断意义较大。LBM—[sG对结脑的诊断有较高的敏感性和特异性。上述改变见表l。襄1 d,JL结核病脑脊液、影像学及病原学结果]．4治疗与转归本组患儿采用3-5种药物联合化疗，包括：异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素及乙胺丁醇；有肝功能异常者，加用门冬氨酸钾镁口服，有结核性脑膜炎者加强的松或地塞米松1—3月。抗痨药物疗程为6—18月，其中6月6例，9月26例，12月13例，15月3例，18月3例。l例鞘内注射异烟肼和地塞米松，共10次。颅内高压明显时，给20％甘露醇，病情缓解后改醋氮酰胺口服，疗程3月左右。治愈51例，死亡7例均为病程晚期，临床类型为脑膜脑炎型的患儿。2讨论2．1小儿结核病的不典型表现本组资料显示小儿结核病远不如成人结核病表现典型，但有以下特点：(1)以高热为主要表现，易误诊为伤寒，败血症等；(2)以类百日咳样咳嗽或反复喘息为主要表现，易误诊为哮喘或咳嗽变异性哮喘；(3)以反复呼吸道感染为主要表现，反复肺炎或迁延性肺炎，经正规治疗后查胸片发现病灶吸收差时应怀疑本病或对患儿作PPD试验，[，)以早期确诊；(4)以浅表淋巴结肿大为主要表现，本组资料提示以浅表淋巴结肿大者与结核菌L型感染有关，极易漏诊或误诊；(5)以消化道症状、营养不良为主要表现，可有腹泻、血便、腹痛、便秘等。2．2小儿结核杆菌L型感染的临床特点结核杆菌通过细菌本身溶菌酶的作用，宿主体内抗体补体等诱导作用及抗菌剂的诱导作用，结核杆菌缺壁成为L型，并长期存在，因其抗原性发生改变或减弱，从而逃避机体免疫的攻击，长期存在体内，在一定条件下L型可恢复成原菌，造成病情复发或病程慢性化；因结核菌L型抗酸染色呈阴性反应，造成临床检测漏检。另外结核菌L型胞壁表面脂质减少，不引起机体皮肤迟发性超敏反应，故OT或PPD试验阴性。本组研究资料表明小儿结核杆菌L型有以下特点：(1)发病年龄以儿童为多；(2)淋巴结肿大最常见；(3)部分病儿伴有不规则发热或周期性发热或呼吸道感染或结核中毒症状；(4)少数病儿以发热、贫血、淋巴结肿大、脾肿大为主，极易误诊为血液系统肿瘤；(5)传统诊断结核的方法如胸片、PPD或OT试验及一般的病理学检查均难以确诊，诊断依赖于改良的抗酸染色和结核抗体免疫组化染色等方法有助于结核菌L型感染的诊断。2．3小儿结核性脑膜炎的特点小儿结核性脑膜炎因临床表现及CSF均不典型，常导致误诊c4“]。本组资料起病缓慢有性格改变仅2例，大多数以发热伴中枢神经系统功能紊乱为主要表现，且神经系统体征及CSF改变均不典型，极易误诊为病毒性脑炎或化脓性脑膜炎。下列几点值得临床医作者单位：安徽蚌埠医学院附属医院(蚌埠，)

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